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4D新時代!更精確的磷酸化修飾組學

發布時間: 2019-08-06
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離子淌度分離概念的引入使得蛋白質組學進入了4D新時代。4D蛋白質組學是在3D分離即保留時間(retention time)、質荷比(m/z)、離子強度(intensity)這三個維度的基礎之上增加了第四個維度,離子淌度(mobility)的分離(圖1),并大幅度的提高掃描速度和檢測靈敏度,帶來蛋白質組學在鑒定深度、檢測周期、定量準確性等性能的全面提升。


4D新時代!更精確的磷酸化修飾組學

圖1. 新一代4D蛋白質組學示意圖


磷酸化是研究最廣泛的翻譯后修飾類型,在生長發育、信號轉導以及包括癌癥在內的各種疾病進程中都發揮著至關重要的作用。而隨著科學的逐漸深入和技術的不斷進步,基于質譜的磷酸化修飾組學也引起了人們越來越多的關注,并有力推動了磷酸化功能研究的進展。


然而對于傳統的質譜技術來說,要想實現磷酸化的深度和精確鑒定存在著兩大挑戰,1)生物樣品中不同的磷酸化肽段豐度會呈現出幾個數量級的差異,這需要更高的質譜掃描速度和靈敏度來鑒定到低豐度的磷酸化肽段;2)同一個肽段發生磷酸化位點的不同,會造成同分異構的磷酸化肽段,并且這些同分異構的磷酸化肽段大部分會在色譜上共洗脫,而傳統蛋白組學質譜平臺不能對這些共洗脫的同分異構肽段進行分離。


現在得益于質譜技術的進步,采用基于Bruker?timsTOF?Pro平臺的4D蛋白質組學技術,這兩大問題都得到極大的改善,除了在蛋白質組分析方面展現出的極佳的靈敏度和覆蓋深度,根據我們最近的測試結果,其在磷酸化修飾分析上更加展現出了強大的優勢(圖2)在檢測深度方面,能夠高效快速地從不同細胞組織中平均鑒定到8000-10000個高可信度的磷酸化修飾位點(localization?probability>0.75),相比傳統技術提升50%以上。


4D新時代!更精確的磷酸化修飾組學

圖2.?A. timsTOF Pro的高速掃描循環;B.?4D磷酸化技術鑒定磷酸化位點的數目


除了檢測深度和效率,磷酸化組分析的另一大難題是同分異構現象:例如圖3中的兩個同分異構體的磷酸化肽段,分子序列完全一樣,只是發生磷酸化的位置不同,這些同分異構的磷酸化肽段在一級譜圖上的質量完全相同,而在二級譜圖上也高度類似。面對這樣微小的差別,傳統的質譜鑒定和搜庫軟件通常難以做明確的區分,極易導致出現錯誤定位(false?localization)的問題。為限制錯誤定位的情況,目前主要是通過多種評估軟件或算法來進行打分和篩選,但這些統計的方法并沒有在質譜鑒定水平上解決修飾位點準確定位的問題,只能夠識別出錯誤的位點,但不能讓這些位點被正確的檢出。


4D新時代!更精確的磷酸化修飾組學

圖3. 磷酸化肽段的同分異構


更為令人擔憂的是,這種同分異構的現象不但棘手,而且其存在是相當普遍的。根據大規模的分析測試結果,估計至少26%的磷酸化肽段存在同分異構的現象,且其中50%的同分異構體在色譜上無法做到有效的區分(圖4B)。對于這些修飾肽段信號的精確識別,傳統的方法技術則顯得束手無策。


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圖4. 同分異構磷酸修飾肽段比例以及在不同保留時間的分布


現在,這些問題終于有了根本上的解決方案。新一代的4D蛋白質組學除了在蛋白鑒定上有著卓越的性能,新增的離子淌度分離還能解決同分異構的問題,使得PTMs的鑒定更加可靠。 很多磷酸化肽段的同分異構體其洗脫時間和質荷比完全一樣,但是由于發生磷酸化的位置不同,所以在結構上會有差別,在經過4D蛋白質組學的離子淌度分離就會被有效地分離開來。離子淌度和HPLC兩個層面的聯合分離,能夠最大程度地區分和識別這些共洗脫的修飾肽段信號。


為了便于大家理解這種聯合分離的作用,我們再看一個實際檢測的例子,如圖4所示:5號和6號肽段其保留時間和質荷比完全一樣,但是通過離子淌度可以很好的分離鑒定。同時,6號和7號肽段離子淌度和質荷比一致,但可以通過保留時間進行區別。全部7個肽段中有5個可以通過離子淌度進行準確鑒定,但是保留時間只能鑒定2個。

4D新時代!更精確的磷酸化修飾組學?圖5. 離子淌度對于同分異構磷酸化肽段的分離


通過以上的介紹我們發現,4D蛋白質組學除了在蛋白質組分析方面展現出的極佳的靈敏度和覆蓋深度以外,還能夠帶來更精確的磷酸化修飾的鑒定,大幅度提高翻譯后修飾位點定位的可靠性,再次展現了4D蛋白質組學強大的功能和廣泛的應用前景。


參考文獻:

1.?Heiner Koch,et al., The PASEF method on a TIMS-QTOF mass spectrometer for High Sensitivity Phosphoproteomics. ASMS 2018, TP 555

2.?Christopher M. Adams, et al., Identification and Quantitation of Phosphopeptide Positional Isomers using Trapped Ion Mobility Spectrometry and PASEF. ASMS 2019, WP 662



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